张锋领衔开发全新mRNA递送平台SEND

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文 | 学术头条，作者 | 朱哼哼，编辑 | 王新凯

2020 年初，新冠疫情肆虐全球，各国药企均大力投入疫苗研发，希望及时研发出有效疫苗以阻止疫情扩散，这也让原本还远离大众视线的 RNA 疗法，广为人知

相比于传统疫苗，RNA 疫苗仿佛是专门为新冠疫情准备的。美国疫苗生产企业 Moderna 在得到新冠病毒基因组序列后，仅用了 4 天，就获得了新冠病毒刺突蛋白编码片段，并合成相应 RNA，随后将其封装便可作为新冠疫苗。

RNA 疫苗被递送至人体后，可在人体细胞内源源不断的产生病毒蛋白，相当于将机体转化为“疫苗工厂”，训练免疫系统识别病毒入侵。然而，由于缺乏稳定、强大的 RNA 递送平台，RNA 疫苗的使用始终受限。

现在，RNA 疫苗使用的局限性有望被打破。

来自麻省理工学院的华人科学家张锋教授带领的研究团队，成功开发了一种全新RNA递送平台——SEND。SEND 以人体内天然存在的 RNA 运输蛋白 PEG 10 为基础，通过对 PEG 10 蛋白进行改造就可以将不同的 RNA 运送到不同的细胞或器官。由于是天然存在于人体中的蛋白质，该平台相较于其他 RNA 递送方法可以有效避免机体的免疫攻击。

该研究以“Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery”为题，发表在最新一期的 Science 杂志上。

对于这一研究结果，CRISPR基因编辑技术的先驱者、Broad研究所核心研究成员、McGovern研究所研究员张锋表示，“生物医学界一直在开发强大的分子疗法，但是如何将它们精确有效的传递给靶细胞，仍旧具有挑战性。而 SEND 有望克服这些潜在的挑战。”

一切蛋白质层面的疾病，都可以使用 RNA 疗法解决

目前上市的小分子药物，绝大部分的靶标都是蛋白质，这一策略在过去数十年来也带来了大量好药和新药，据估计，接近 99%的口服药物靶向的是致病蛋白。

但新药研发人员对此却并不满足。首先，不少蛋白质无“可成药性”，这意味着很难对其开发具有抑制性的小分子；其次，蛋白只占了基因组信息的极少部分。人类的基因组中，只有 1.5%的序列编码了蛋白质，和疾病相关的蛋白更是只占其中的 10-15%。毫无疑问，如果小分子药物的靶点能超越蛋白质，将给新药研发带来新的变革。

RNA 就是这样一种潜在的靶点。在正常细胞中，RNA 有着重要的生理功能——mRNA 携带了基因的遗传信息，指导蛋白质的合成；非编码 RNA 则调控基因的表达。

靶向RNA也有着多种好处：由于处于蛋白质的上游，靶向 RNA 有望直接对蛋白质的翻译效率进行上调或下调，解决蛋白“不可成药”的难题；RNA 在人类基因组中极为丰富，产生非编码 RNA 的序列更是占到了基因组的 70%，丰度比编码蛋白质的序列高出一个数量级。

然而在既往的几十年间，由于 RNA 分子容易降解，在体内半衰期很短，一直被认为无法成为“治疗药物”。

直到近年来，随着技术进步以及稳定性化学的改进，半衰期较短的 RNA 分子反而成为了临床新宠，逐渐吸引了业界的注意，进入爆发增长阶段。

作为一种新型疗法，RNA 药物的研发周期短、生产工艺简单、成本低、效果强、产能扩张迅速、安全性更好，这是其天然的优势。例如，疫情期间，新冠病毒 RNA 疫苗的研发在得到病毒基因序列后数天之内就完成了，其疗效也得到了真实世界数据的验证。

目前，RNA 疗法的应用前景十分广阔，包括疫苗、肿瘤免疫治疗、单抗药物替代、蛋白药物替代、辅助生殖等等。理论上，一切蛋白质层面的疾病都可以通过 RNA 疗法治疗。

RNA药物的最大障碍：递送

虽然 RNA 药物的应用前景非常广阔，但是目前 RNA 药物的研发也面临着一个巨大的挑战，那就是 RNA 递送的问题。

核酸药物想要进入体内，主要有以下3个难关：核酸的分子量和负电荷使其不能自由通过生物膜；RNA 容易被血浆和组织中 RNase 酶降解，被肝脏和肾脏快速清除和被免疫系统识别；进入细胞后 “卡” 在内吞小体中无法发挥功能。

以上几点让 RNA 药物发展面临的技术障碍——药物递送，一直没有得到解决。目前，解决递送问题主要有两个方法：一个是改造核酸分子，让其稳定并躲避免疫系统的识别；另外一个就是利用药物传输系统，比如说脂质纳米颗粒（LNP）和载体病毒。

纳米脂质体递送 RNA 的原理目前还不完全清楚，但是通常认为，纳米脂质体通过非共价亲和力和细胞膜结合并通过内吞作用被摄取，进入细胞后 RNA 逃离内吞小泡，被释放到细胞质中表达靶蛋白。纳米脂质体还可以通过相反的胞吐作用被排出细胞外，这也是通过纳米脂质体进行 RNA 给药需要注意的点。

目前 RNA 还是主要依靠纳米制剂递送，而由于纳米脂质体的限制，所以目前RNA疗法仅适合肝脏、脾脏靶向治疗，其他组织难以靶向。同时，mRNA 药物过膜性低也导致出现悬殊的个体差异，如果药物过膜性是 1%，那么 1% 的个体差异会导致两倍有效药物浓度差异，但如果过膜性是 50%，那么 1% 的个体差异则无关紧要。

现在业界的策略是，首先选择疫苗这样安全窗口较大的项目，但如果扩大到更复杂靶点，业界需要找到可监测药物应答的生物标记。

打破RNA治疗困境

PEG 10 蛋白天然存在于人体内，源自一种类似病毒的遗传元件——“逆转录转座子”。PEG 10 蛋白在数百万年前被整合进人类祖先的基因组中，随着时间的推移，PEG 10 已与人类基因组融为一体，在人体内发挥重要的功能。

此前，研究人员发现，另一种逆转录转座子衍生蛋白 ARC 可以形成病毒样结构，并参与细胞间 RNA 的转移。这一研究结果表明，逆转录转座子相关蛋白或许可以作为 RNA 递送平台用于 RNA 疗法，但是此前科学家尚未成功利用 ARC 蛋白在哺乳动物细胞中运送 RNA。

为了进一步探索逆转录转座子蛋白的功能，张锋教授带领研究团队对人类基因组中的逆转录转座子蛋白进行了系统的搜索，寻找潜在可以运输 RNA 的蛋白质。

初步分析显示，人类基因组中有 48 个基因可能编码了逆转录转座子蛋白。其中，有 19 中蛋白质同时存在于小鼠和人类中。

在体外研究中，研究人员发现，逆转录转座子蛋白 PEG 10 是一种高效的 RNA 载体蛋白。相比于其他逆转录转座子蛋白，PEG 10 在哺乳动物细胞内穿透性更强，且本身就参与 RNA 运输。

随后研究人员在 PEG 10 蛋白的 mRNA 中找到了识别和包装 RNA 的分子序列。通过对 FEG 10 蛋白 mRNA 分子包装序列，以及 PEG 10 蛋白进行修饰，研究人员试图让 PEG 10 蛋白搭载不同的 RNA，并靶向不同的细胞。

最终，研究人员开发了两种不同蛋白修饰的 PEG 10 蛋白，并在细胞试验中实现靶细胞 RNA 递送。

对此，张锋教授表示，“我们的研究表明，通过对 PEG 10 蛋白的 RNA 包装组件和识别组件进行改造，理论上就可以针对不同的疾病治疗提供一个模块化的平台。”

由于 SEND 平台所用的 RNA 载体均来源于体内天然蛋白自，这意味着这一系统不会触发机体免疫反应，副作用大大降低。未来，SEND 技术或将替代纳米脂质体和病毒载体，成为最适合基因编辑疗法的载体。

下一步，该团队将会在动物体内测试 SEND，并进一步设计和开发更多的逆转录转座子蛋白，以便将更多的 RNA 递送至各个组织和细胞。

• 参考资料：
  https://science.sciencemag.org/content/373/6557/882
• https://news.mit.edu/2021/send-peg10-drug-delivery-0819
• https://www.nature.com/articles/s41578-021-00358-0
  

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解析MIT张锋领衔开发的mRNA递送平台｜专访国家纳米科学中心王海

“未来，SEND技术或将替代脂质纳米载体和病毒载体，成为最适合基因编辑疗法的载体，”8月21日，国家纳米科学中心研究员王海告诉DeepTech，他十分赞可CRISPR先驱张锋最新开发的mRNA递送平台。

日前，MIT博德研究所张锋教授团队，开发了一种名为SEND的新系统，该系统利用人类蛋白质来提供分子治疗。

有观点认为“该成果打破了RNA的治疗困境”，对此国家纳米科学中心研究员王海告诉DeepTech：“我非常认同这一评价。由于RNA分子容易降解，在体内半衰期很短，过去一直被认为无法成为‘治疗药物’。直到针对新冠病毒的mRNA疫苗的出现，才让人们对RNA药物的开发重新燃起希望。目前使用的mRNA载体主要为病毒载体和脂质纳米载体—LNP，但病毒载体不利于持续给药，而LNP本身就具有一定的细胞毒性。”

“该成果开发出继病毒载体和LNP后第三种可靠的RNA载体，这一系统不会触发机体免疫反应，副作用大大降低。未来，SEND技术或将替代脂质纳米载体和病毒载体，成为最适合基因编辑疗法的载体，”王海表示。

8月20日，相关论文以《哺乳动物逆转录病毒样蛋白PEG10能包装其自身的mRNA并实现递送》（Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery）为题，发表在Science上。

问题：RNA疗法仍面临很多挑战

王海告诉DeepTech，该研究要解决的痛点在于，药物的脱靶效应是全身给药的主要瓶颈，药物在非靶器官的高聚集、或者在靶器官的富集程度非常低，都有可能影响药物安全性和治疗效果，这也是造成药物研发失败的常见原因之一。此外，特定组织或特定细胞的靶向递送，面临着生物学屏障系统的挑战。

药物注射到血管内部后，会遇到进入组织后第一层生理屏障——血管内皮屏障，它仅能允许部分小分子药物从血液到达组织，但对于核酸、抗体等大分子药物，则很难透过这层屏障进入组织。在特定疾病状态下，血管内皮细胞会发生功能紊乱，从而导致血管内皮通透性发生改变，而这会增加药物进入组织的效率。

并且，在成功透过内皮层屏障后，药物需要穿过细胞外基质才能到达靶组织。小分子化合物可轻易穿过细胞外基质，而较大分子则会在细胞外基质中受到较大阻力。

而特定疾病状态可显著改变细胞外基质微环境，并形成新的生物学屏障。在到达靶组织后，靶向细胞内结构的治疗药物，需跨过细胞膜到达胞浆或核内靶标，只有这样才能发挥生物学效应。

王海表示，疏水性小分子相对容易穿过细胞膜，而大分子及纳米颗粒则需要经过主动重摄取机制进入细胞，这一过程需要和细胞膜相互作用，并通过随后的细胞内吞机制进行。其中，内吞的大分子及纳米颗粒，可通过内涵体、吞噬体、溶酶体等细胞内囊泡结构进行转运。

因此，这些细胞内结构又成为药物分子进入胞浆的另一层生物学屏障。这意味着，对于核酸和多肽类药物的递送来说，它们本身稳定性差的问题也亟需克服。可以说，如何提高这些药物的稳定性，是药物递送面临的严峻挑战。

张锋也告诉媒体：“现有的分子疗法传递载体可能效率低下，并导致基因疗法随机整合到细胞基因组中，这两者都会增加副作用的风险。此外，有些会刺激不需要的免疫反应。”

因此开发出可安全递送RNA的递送系统，是该领域面临的最大挑战。RNA特别是裸露的RNA会被核酸酶降解，核酸酶会通过吞噬RNA在生理环境中的核酸而“茁壮成长”。所以，使用不激活人体免疫系统的方式来包装RNA，对于防止药物不良反应来说也很重要。

尽管在人眼范围内RNA非常小，但在分子生物学里RNA并不算小，因此通过细胞膜递送它可能会很麻烦。这就好比当你要邮寄一只玻璃杯，肯定会选择最靠谱的快递公司，对RNA来说同样如此。

办法：SEND打开一个新的传递路线

此次张锋团队联合提出的新型递送平台SEND，是一种选择性内源性的封装细胞传递，该团队相信SEND有潜力克服上述挑战。

他告诉媒体，在SEND系统内混合和匹配不同的组件，将为研发针对不同疾病的疗法打开一扇大门。SEND的技术原理在于利用人体细胞自身合成的PEG10蛋白，它能结合其自身的mRNA并在其周围形成一个球形保护胶囊。

此次研究中，该团队设计了PEG10以选择性地包装和递送其他RNA，并使用SEND将CRISPR-Cas9基因编辑系统传递给小鼠和人类细胞以编辑目标基因。这表明，人体中可能还有其他RNA转移系统也可用于治疗目的。

要了解SEND的工作原理，先得弄懂一种上述名为PEG10的蛋白质，它是逆转录转座子衍生蛋白质的其中一种。转座子是一段能“移动”的DNA片段，它通过“复制和粘贴”机制来实现在基因组中的移动。

而逆转录转座子则是将DNA序列转录为RNA后，再通过RNA转移到基因组上的目标位点，并通过逆转录酶逆转录为DNA序列，从而实现在基因组中的移动。

此前有研究表明，另一种名叫ARC的逆转录转座子衍生的蛋白质，可形成类似于病毒的结构，并能够在细胞之间转移RNA。因此，是否有可能将逆转录转座子蛋白设计为遗传物质的“信使”？

之前曾有学者有过这种设想，但尚未得到证实。而张峰团队在人类基因组中，鉴定了许多种逆转录转座子衍生的蛋白质，其中就包括PEG10。

它的衣壳内主要包含其自身的mRNA，这说明它有一个特定的机制去指导包装过程。因为，研究人员希望利用它来重新编程PEG10包装。

效果：SEND在人类细胞和小鼠细胞中均测试成功

这项成果涉及多个步骤，首先研究人员在PEG10的mRNA中找到了PEG10蛋白识别和包装的关键分子序列。然后，研究人员通过改造PEG10蛋白来实现其对其他RNA的识别和包装作用。

最后，他们在PEG10胶囊的表面进行一定的靶向修饰，以实现组织或细胞的靶向性。为了测试SEND技术是否可行，该团队采取用PEG10递送一段编码荧光蛋白的信使RNA。他们发现细胞可以开始发出荧光，因此这种策略是可行的。

接下来，他们用PEG10蛋白实现了对Cas9 mRNA以及sgRNA进的包装。通过SEND技术，他们发现，人类细胞和小鼠细胞基因组的目标位点均成功实现了基因编辑。

概括来说，此次成果表明，通过改造PEG10蛋白的RNA包装组件和识别组件，理论上能针对不同疾病提供模块化的治疗平台。谈及可带来的好处，王海告诉DeepTech，现有的病毒载体一般只能注射一次，不能持续给药，因为病毒会引起人体的免疫反应，还会加速药物的清除速度，甚至产生严重的不良免疫反应，这给当前的分子疗法有非常大的局限性。

而通过此次方法，有望减少人体对mRNA运输载体的免疫反应，让以蛋白为载体进行常规的mRNA靶向运输成为可能。

王海总结称，这或将推动分子疗法进入下一个快速发展的阶段，此外这种模块化的平台还能降低成本，有利于推动分子疗法的产业化。目前，该研究仍处于早期阶段，但张锋等人对这一初步结果感到十分鼓舞。

接下来，研究人员还得了解SEND系统在体内的工作情况，并进一步优化该系统，以便将RNA运送到各种组织和细胞。未来，他们还将继续探索SEND系统在人体中的自然多样性，来确定其他组件是否也能被添加到SEND中。